20年に及ぶ実験が限界に到達
核移植を3万947回試み、1匹の雌からクローンによって1,200匹以上のマウスを生み出した日本の研究チームは、約20年にわたる実験を終えた。第58世代で生まれた5匹は全て翌日に死亡し、研究者がかつて無限に続くと考えていた系統に終止符が打たれた。
目次
2005年から2025年にかけて行われたこの実験では、クローンを繰り返すことで有害なDNA変化が蓄積することが分かった。出生率は当初、第1世代の約7％から第26世代の15.5％へと上昇した。第27世代から低下に転じ、最終的には0.6％に達した。これは、代理母に移植されたクローン胚1,000個当たり、およそ6匹が出生する水準だ。
研究成果は、Nature Communicationsに掲載された論文「連続クローン作製の限界」にまとめられた。山梨大学は、同大先端バイオテクノロジーセンター長の若山照彦教授と若山さやか准教授が研究者に含まれると、研究発表で明らかにした。
最も示唆的だったのは、外見と繁殖能力の対照だ。系統内の多くのマウスは健康そうに見え、約2年間生きたが、世代が進むにつれてクローン作製でも通常の交配でも繁殖が難しくなった。
山梨大学でマウスのクローン研究を先駆けた若山照彦教授は、実験の背景にある問いを、よく知られた例えで説明した。
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マウスに生じた変化には、DNAの個々の塩基と、染色体のより大きな領域の両方が関わっていた。研究は、こうした変化の蓄積と、最終的な出生率の急落との関連を示している。
クローンからクローンを作る方法
研究チームは体細胞核移植を用いた。体細胞とは、卵子や精子ではなく、体を構成する細胞だ。研究者は細胞の遺伝情報の大半を含む核を取り出し、核を除去した未受精卵に移植した。
その後、卵子が遺伝情報をリセットし、成体の体細胞由来の核が胚の発生を指示できるようにする必要がある。研究者はできた胚を代理母に移植し、生まれたクローンのうち生存した個体の細胞を使って次世代を作った。
核の提供元には、卵子を取り囲み、支える顆粒膜細胞を使った。最初の提供元は、アグーチ毛色の雌マウスだった。この毛色は、1本1本の毛にある色素の帯によって生じる。クローンマウスは全て雌で、同じ毛色を持っていた。
研究者は年に約3～4世代を作り出した。保存していた最初の提供元の細胞から毎回直接マウスを作るのではなく、新たなクローン個体を経由して系統を繰り返しつないだ。この方法により、ある世代から次の世代へ受け継がれる変化を追跡できた。
初期の結果が有望に見えた理由
理化学研究所が2013年3月に発表した内容では、実験はなお順調に進んでいるように見えた。論文投稿時点で25世代にわたり581匹を作出し、発表時には26世代で598匹に達していた。
研究者は、移植した核の遺伝子活性のリセットを助ける薬剤、トリコスタチンA（TSA）を使用した。それまでマウスの連続クローン作製は約6世代が限界だった。TSAの使用と実験条件の改善により、出生率は一貫して低下するのではなく、上昇した。
当時は健康状態、繁殖力、寿命、染色体末端の測定結果も良好に見えた。そのため研究者は、この過程が無限に続く可能性があると考えた。同じ系統をさらに10年追跡したことで、最初の25世代では見えなかった問題が明らかになった。
主な節目をたどると、結論がどのように変化したかが分かる。
- 2005年：連続クローン作製を開始。最終論文は開始を1月としているが、理研の2013年の発表では年末頃としている。
- 2013年3月8日：理研が26世代で598匹の作出を発表。出生率は約15％に達していた。
- 第27世代以降：世代ごとの変動はあったものの、出生率は持続的な低下に転じた。
- 2025年：第58世代で実験を終了。同世代で生まれた5匹は全て翌日に死亡した。
DNAの内部で何が変わったのか
ゲノム解析により、第1世代から第57世代までの間に約3,700個の一塩基変異と、80個の小規模な挿入または欠失が確認された。一塩基変異（SNV）とは、DNA配列の1文字が変化することだ。挿入や欠失は、その配列の短い部分が加わったり失われたりする変化を指す。
論文では、1世代当たりの平均をSNVが69.4個、小規模な挿入・欠失が1.4個と算出した。DNAの変化の多くは影響が小さいが、正常な発生や繁殖に必要な指示を妨げるものもある。
比較のため、研究者は約20年にわたり60世代、兄妹交配で維持された2系統のマウスを調べた。これらの系統では、1世代当たりのSNVは平均22.3個だった。69.4個と22.3個を比べると、クローン系統の変異率は約3.1倍だった。
タンパク質を壊したり変化させたりすると予測された小規模変異の割合も増えた。第1世代から第23世代の間に生じた変化では0.52％だったが、第23世代から第57世代の間に生じた変化では1.19％に上昇した。
研究者はDNAからマウスの系譜も再構築した。記録された実験上の系譜と一致し、実験を通じて系統が最初の提供元の子孫であり続けたことが確認された。
染色体の大きな変化も負担に
マウスにはDNAの個々の塩基の変化だけでなく、より大きな変化も蓄積した。解析では、第1世代から第57世代までに約80～84個の新たな構造変異が見つかった。構造変異とは、DNAの配置や量に生じる大規模な変化を指す。
16個の大規模変異は、DNAの4万塩基以上に及ぶ領域に関わっていた。X染色体の一方の喪失、第4染色体の大きな変化、第7染色体と第9染色体の間での遺伝物質の交換などが確認された。
研究者の推定では、第57世代までに、X染色体の喪失を数えなくても、遺伝子機能を失わせる変異が約30個、遺伝子にコードされたタンパク質の指示を変える変異が約50個に達していた。また、2つの大きな欠失が同じ領域に影響し、Csmd1という遺伝子の2つのコピーの機能をともに失わせていた。
著者らは、出生率の低下を変異の負担の蓄積と結び付けている。実験終盤にさらに有害な変化が加わり、すでに大きく変化していたゲノムが、発生中のマウスが耐えられる限界を超えたという説明だ。
変異率が高くなった原因は、まだ明らかになっていない。体細胞核の移植を繰り返すことが関与している可能性があり、体細胞には動物の生涯を通じて変異が蓄積することもある。また、通常の有性生殖がないことも、変異が世代を超えて受け継がれる仕組みを変える。
遺伝子活性のリセットだけでは不十分だった理由
クローン作製では、DNAを卵子に移すだけでは足りない。卵子は、どの遺伝子が働くかを決める化学的な目印もリセットしなければならない。こうした目印はDNA配列を変えずにその働きを調節するため、エピジェネティックな目印と呼ばれる。
研究者は、リセットの失敗がクローン作製のたびに悪化する可能性を疑っていた。しかし測定結果からは、後半の低下を主に説明するのはDNA変異の蓄積だと考えられた。
クローンマウスでは、マウスのクローン作製で知られる特徴である胎盤の肥大が見られた。実験を通じた胎盤の平均重量は約0.30グラムで、体外受精によって作られた対照群の0.11グラムを上回った。ただし、世代を重ねるにつれて胎盤重量が増加し続けることはなかった。
初期胚の複数のエピジェネティックな目印を調べた結果、新たに作製したクローンと第51世代のクローンでは、全般的に似たパターンが見られた。TSAの効果も続いており、第51世代の出生率は、投与した場合が5.4％、投与しなかった場合が1.6％だった。
染色体末端にある保護的なDNA配列、テロメアも別の説明候補だった。しかし後期の解析では、調べた世代間で大幅に短縮したことを示す証拠はほとんどなかった。これらの検査結果は、DNA配列と染色体構造に生じた変化の負担が増大したことに注目を促した。
健康そうに見えるマウスの産仔数は減少
通常の交配によって、外見からは見落としやすい繁殖能力の低下が明らかになった。第20世代の雌は正常な雄と交配すると、1腹当たり平均9.9匹を産んだ。対照群の10.3匹に近い数だった。
その後、平均産仔数は第50世代で2.8匹、第55世代で2.2匹に減少した。後者は、対照群の平均10.3匹と比べて約79％少なかった。
ホルモン刺激後に採取できた卵子の数は、クローンの世代が進んでも減少しなかった。そこで研究者は、卵子を活性化または受精させた後に何が起こるのかを調べた。
正常な雄の精子を使って実験室で卵子を受精させたところ、対照群の胚の97.6％が、着床前の初期段階である胚盤胞まで発生した。一方、第25世代のクローン由来の卵子では39.7％、第53世代では20.3％だった。
第56世代の卵子を使った実験では、核と、それを取り囲む細胞質の双方に問題が見つかった。いずれか一方を対照卵子由来のものに置き換えても、発生率は非常に低いままだった。卵子の両方の部分に機能低下が見られた。
有性生殖で一部の繁殖力が回復
後期世代のクローンから生まれた子の中には、生き残り、より良好に繁殖した個体もいた。第55世代のクローン雌は1腹当たり平均2.2匹だったが、その子の世代では平均7.0匹となり、3倍以上に増えた。
こうした孫世代の胎盤も、クローンマウスに典型的な肥大は見られず、受精によって生じた胚の胎盤に近い大きさだった。
有性生殖では、卵子と精子が形成される際に遺伝物質が組み換わり、受精時にもう一方の親のDNAと組み合わさる。片方の親から受け継いだ正常な遺伝子のコピーが、もう片方から受け継いだ損傷コピーを補うこともある。遺伝的な問題が深刻な胚は発生を停止する一方、機能する組み合わせを持つ胚は生き残る可能性がある。
子孫はクローン雌から変異も受け継いでいた。ゲノム解析では子と孫の双方に変異が見つかり、第7染色体と第9染色体の交換も含まれていた。研究者は、変化した2つの染色体が一緒に受け継がれ、交換による均衡が保たれた可能性を指摘した。
したがって、産仔数の改善は、有性生殖によって繁殖力が部分的に回復したことを示している。クローン作製で蓄積した遺伝的変化の一部を受け継ぎながらも、子孫はより良好に繁殖できた。
保全と畜産への意味
保存した細胞によって、すでに死亡したり繁殖できなかったりする動物の遺伝物質を保全できるため、クローン作製は保全関係者の関心を集めている。畜産では、価値のある形質を持つ動物を増やす手段となる。この実験は、こうした用途では提供元のDNAの状態と子孫の繁殖能力に注意を払う必要があることを示している。
この研究が扱ったのは、連続した提供元を通じて長期にわたりクローン作製を重ねるケースだ。58世代は、この実験条件下における特定のマウス系統の到達点であり、他の系統や哺乳類種で何世代まで可能かは分かっていない。
研究に参加していない、カリフォルニア大学デービス校の発生内分泌学者カタジナ・マリン氏は、種が危機に陥った後にクローンで救うことに頼るのではなく、危機に至らないようにする保全が望ましいと、今回の結果は示していると述べた。
保全団体リバイブ・アンド・レストアのベン・ノバク氏は、動物の生涯を通じて体の組織に蓄積する変異の重要性を指摘した。提供細胞はそれ自体がDNA変化の履歴を持つため、その細胞が別の動物を作る出発点となる際に重要となる。
この研究からは、実践的な教訓が2つ得られる。クローン作製は、動物の遺伝物質を何世代にもわたって利用できるようにする一方、健康な子孫を維持できるかどうかは、そのDNAが時間とともにどう変化するかにも左右される。この実験では、クローン系統が終わりに近づいた後、通常の交配によって一部の子孫の繁殖力が回復した。
要点
- 研究者は核移植を3万947回試み、1匹の雌から連続クローン作製によって1,200匹以上のマウスを生み出した。
- 出生率は第26世代で15.5％に達した後、実験終盤には0.6％まで低下した。
- 第58世代のマウスは5匹全てが出生翌日に死亡し、2025年に系統が途絶えた。
- クローン系統では、兄妹交配で維持された比較系統の約3倍の一塩基変化が1世代当たりに蓄積した。
- 有害なDNA変異と大規模な染色体変化が蓄積した一方、測定されたエピジェネティック異常は世代とともに悪化しなかった。
- 一部の子孫では有性生殖によって繁殖力が改善したが、受け継がれた変異は残った。
